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chunshiluoye的博客

 
 
 

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感受态细胞的制备  

2009-06-16 12:02:17|  分类: 分子生物 |  标签: |举报 |字号 订阅

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1.挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中,37℃摇床过夜。

2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中,18℃剧烈震荡,直到A600达到0.6。

3.将培养物转移到50ml离心管中,4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。

4.弃上清,将离心管倒置于滤纸上,使培养液被吸干。

5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀,再加入15ml TB(1/3体积的起始培养液),冰浴10-15min,4℃ 4,000rpm/min离心10min。

6.弃上清,沉淀重悬于4ml TB(1/12.5体积的起始培养液),冰浴10min。

7.加入280μl  DMSO,缓缓滴入并轻轻摇晃,使其充分混合均匀,冰浴10min。

8.将菌液分装于EP管中,-80℃或液氮冻存。

9. 取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O(阴性对照)和1μl纯质粒(阳性对照)进行转化(见后),以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长,阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

SOB的配制:

蛋白胨        20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.58g

KCl           0.186g

100×Mg++溶液 10ml

溶解并加水定容至1L,121℃×20min高压蒸汽灭菌

100×Mg++溶液:  

MgCl2﹒6H2O

MgSO4﹒7H2O

溶解并加水定容至100ml,121℃×20min高压蒸汽灭菌

TB溶液的配制:

   1M  KCl                       5ml

0.55M MnCl2                    2ml

0.5M  CaCl2                    0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7)             2ml

ddH2O                         10.4ml

Total                         20ml

注:上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制:

     称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中,此时粉末不能完全溶解,用10N KOH或KOH固体调节PH值,只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解,此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

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