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碱变性法提取质粒DNA  

2009-06-12 15:15:53|  分类: 分子生物 |  标签: |举报 |字号 订阅

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【基本原理】

普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是,利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱变性条件下(pH 12.6),染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。

【试剂】

所有的试剂均需高压灭菌(有机溶剂除外) 

1 .溶液 I

50mmol /L 葡萄糖

 

25mmol/L Tris -Cl pH8.0

 

10mmol/L EDTA pH8.0

2 .溶液 II

0.2mol/L NaOH

 

1%SDS

 

临用前配制

3 .溶液 III

5mol/L 乙酸钾 60ml

 

3mol/L 冰乙酸 11.5ml

 

ddH 2 O 28.5ml

 

pH 5.2

4 RNase A

10mg/ml

5 TE 缓冲液:

1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-Cl pH8.0

6 Tris-Cl pH8.0 )饱和苯酚

 

7 .氯仿 / 异戊醇( v/v ):

24/1

8 70% :乙醇

 

9 LB/Amp

LB/ 氨苄青霉素( 50 μ g/ml


【操作步骤】

1.从选择性培养平板上取出一个菌落,移至含有2ml LB/Amp培养基的试管中。在37℃条件下振荡培养12-16h。

2.将1.5ml培养物移至1.5 ml Eppendorf管中,4000 rpm离心8min。

3.弃上清,将细菌沉淀悬浮在100μl预冷的溶液I中,并加入2.5μl RNase A(10mg/ml)。

4.加200μl新配制的溶液II, 盖紧管口。快速颠倒离心管5次使内容物混合、放置冰上5min。

5.加150μl预冷的溶液III,盖紧管口。将管颠倒5-8次,冰上放置20min。

6.离心(1000rpm,4℃,5min),将上清转移到另一离心管中。

7.加等体积苯/氯仿/异戊醇,振荡混匀,离心同上。

8.将水相移至另一离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min。

9.10 000rpm 4℃离心10min。

10.弃上清,加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀,离心弃上清,在空气中使质粒DNA干燥10min。

11.将质粒DNA溶于20μl,ddH2O中,4℃保存。

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