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基因工程质粒介绍   

2009-06-11 11:45:19|  分类: 分子生物 |  标签: |举报 |字号 订阅

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  在基因工程中,通常是把外源DN***断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。

     载体的本质是DNA。经过人工构建的载体,不但能与外源基因相连接,导入受体细胞,还能利用本身的调控系统,使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。目前,将外源基因运送到原核生物细胞的载体研究的较多,运送到植物和动物细胞中去的载体还处于探索阶段。本章以原核细胞载体为主,讨论各类载体的结构、功能以及构建过程。

在基因工程中所用的载体,主要有5类,

(1)   质粒(Plasmid),主要指人工构建的质粒。

(2)   噬菌体的衍生物。

(3)   cosmid(柯斯质粒)。

(4)   单链DNA噬菌体M13。

(5)   动物病毒。

     各类载体的来源不同,在大小、结构、复制等方面的特性差别很大,但作为基因工程用的载体,以下三方面是它们共有的特性和基本要求:  (1)在宿主细胞中能独立自主的复制,即本身是复制子。(2)容易从宿主细胞中分离纯化。(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。各类载体具有自己独特的生物学特性,可以根据基因工程的需要,有目的的选择合适的载体,为此,分别介绍各类载体。

一、质粒载体

    质粒是一种裸露的,比病毒更简单的,有自主复制能力的DNA分子,是处于生命与非生命的分界线

   (一) 质粒的一般生物学特性

   质粒(plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子,它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入,在基因工程中,多使用大肠杆菌质粒为载体。质粒分子的大小为1—200kb,质粒和病毒不同,它是裸露的DNA分子,没有外壳蛋白,在基因组中,也没有溶菌酶基因。质粒可以‘友好”的“借居”在宿主细胞中,也只有在宿主细胞中,质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达,赋予宿主细胞各种有利的表型。

1.质粒的类型   

  在大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒,其中对F质粒,R质粒和Col质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在,寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下:

  F质粒:又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。 F因子是雄性决定因子,所以F+细胞又叫雄性细胞,与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构,它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下,将雄性细胞和雌性细胞混合培养,由于性须的作用,就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间,雄性细胞中的F因子按滚环复制模式,经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子,也变成为F+细胞。

  F因子不但能够通过接合作用实现自我转移,而且还能够带动寄主染色体一道转移。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞(高频重组细胞),就有可能引发寄主染色体发生高频转移。但F因子的这种整合作用是一种可逆的过程,因此在一定的条件下,Hfr细胞又可重新变成F+或F细胞。

  R质粒:也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因,此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力

  Col质粒:此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因,即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白,它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。

  根据质粒DNA中是否含有接合转移基因,可以分成两大类群:即接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒亦称自我转移的质粒,这类质粒除含有自我复制基因外,还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因,如F质粒,部分R质粒和部分Col质粒。非接合型质粒亦称不能自我转移的质粒,此类质粒能够自我复制,但不含转移基因组,因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞。从基因工程的安全角度讲,非接合型质粒用作克隆载体更为合适。

 2.质粒的复制类型

  一种质粒在一个细胞中存在的数目,称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少,可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒,称“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid),此类质粒每个宿主细胞仅含1~3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid),这类质粒每个宿主细胞可达到10~60份拷贝。

  一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的,这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型,这说明质粒的复制不仅受自身的制约,同时还受到宿主的控制。

    在一般情况下,质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下:

                    分子量大                           分子量小

    接合型质粒   拷贝数少       非接合型质粒    拷贝数多

                    严紧型复制                        松弛型复制

3.质粒的不亲和性

   在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定地共存,这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility),也称不相容性。例如colEI派生质粒,它们之间是互不相容的,也就是说,这些亲缘关系较近的不同质粒,当两种进入同一细胞后,必定有一种在细胞的增殖过程中,被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。

   彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒,则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的,而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。

 

  (二) 质粒载体的基本条件

    以上讨论的都是天然质粒,天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献,但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础,人工改造和组建形成的实用载体。可根据不同的实验要求,加以选择。  

作为理想的质粒载体,应具备以下几个条件:

(1) 能自主复制,即本身是复制子

(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点,并在此位点中插入外源基因片段,不影响本身的复制功能;

(3) 在基因组中有1—2个筛选标记,为寄主细胞提供易于检测的表型特征。

(4) 分子量要小,多拷贝,易于操作。

二、 大肠杆菌质粒载体

1.pBR322质粒

质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体,亦是应用最为广泛的克隆载体,利用pBR322曾克隆到多种基因,虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位,但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒;而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bo1ivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母,“322'’系指实验室编号,以与其他质粒载体如pBR325,pBR327,pBR328等相区别。当然,“BR"恰好与“细菌抗药性”(bacterialresistance)两个词的第一个字母等同,所以有不少人认为pBR322中的"pBR"是“细菌抗药性质粒”的英文缩写。这显然是一种容易使人信以为真的猜想,而事实上只是一种有趣的巧合。

(1)pBR322质粒的结构

pBR322的图谱:

从pBR322质粒的构建过程,可以知道它是由三个不同来源的部分组成的,

第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(ampr);

第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr);

第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)。

(2)pBR322质粒载体的优点

pBR322质粒载体的第一个优点是具有较小的分子量。为了方便起见,大家统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoRI限制酶的识别位点开始,并公认该序列…GAATTC…中的第一个T为核苷酸1(图4—23),然后沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向顺序计数。因此pBR322质粒DNA分子的正确长度是4 363bp。

pBR322质粒载体的第二个优点是,具有两种抗菌素抗性基因可供作挂化子的选择记号。现在已知总共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子都只具有单一的识别位点。其中有7种限制酶:EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI,它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部,另外有2种限制酶:ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内,在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活;还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具有单一的识别位点,在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现象,称之为插入失活效应。

质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应,是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。例如,将外源DN***段克隆在pBR322质粒的BamHI或SalI位点上,由于阻断了tetr基因编码序列的连续性,而使其失去活性,结果便产生出了具有AmprTetr表型的重组的pBR322质粒。将这样的重组质粒转化给野生型(AmpSTetr)的大肠杆菌细胞,并涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基平板上。那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型,因此它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的质粒的转化子克隆。但在这些Ampr表型的转化子克隆中,有一部分具有Tetr表型,另一部分具有Tets的表型。只要将它们涂布在含四环素的选择性培养基平板上,就可以迅速地辨别出它们到底属于什么表型。因为在tetr基因内没有插入外源DN***段的pBR322质粒,其tetr基因是有活性的,由它转化来的Ampr转化子菌落就应该是Tetr的表型,所以AmprTets表型的细胞所携带的pBR322,必定是在其tetr基因上插入了外源DNA的pBR322派生的重组质粒。

pBR322质粒载体的第三个优点是,具较高的拷贝数,而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000~3000个拷贝。这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

2.pUC质粒载体

pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上,组入了一个在其5,—端带有一段多克隆位点的lacZ'基因,而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

(1) pUC质粒载体的结构

此类质粒载体之所以取名为pUC,是因为它是由美国加利福尼亚大学University of California的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的。

一种典型的pUC系列的质粒载体,包括如下四个组成部分:

(a)来自pBR322质粒的复制起点(ori);

(b)氨苄青霉素抗性基因(ampr),但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化,不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点;

(c) 大肠杆菌β—半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α—肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ'基因;

(d)位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ,multiple cloning sites)区,但它并不破坏该基因的功能(图)。(2)pUC质粒载体的优点

与pBR322质粒载体相比,pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性,是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点概括起来有如下三个方面:

第一、 具有更小的分子量和更高的拷贝数

在pBR322基础上构建pUC质粒载体时,仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点,使其分子大小相应地缩小了许多,如pUC8为2 750bp,pUCl8为2 686bp。同时,由于偶然的原因,在操作过程中使pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变,导致rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质,是控制质粒复制的特殊因子,因此它的缺失使得pUC质粒的拷贝数比带有pMBl或ColEl复制起点的质粒载体都要高得多,平均每个细胞即可达500~700个拷贝。所以由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞,可获得高产量的克隆DNA分子。

第二,适用于组织化学方法检测重组体

pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ,基因,在这个基因的编码区中插入了一个多克隆位点。lacZ,基因所编码的α—肽链(编码β—半乳糖酶基因的氨基末端)可参与α—互补作用。这种载体适合于可编码β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性,但它们共处一个细胞中时可融为一体,形成具有酶学活性的蛋白质。这样,LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补,这种互补现象叫做α—互补。由α—互补而产生的Lac+细菌易于识别,在诱导物异丙基—β—D—硫代半乳糖苷(IPTG)存在时,它们在含有生色底物5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的平板上形成蓝色的菌落。当多克隆位点中插入外源DN***段时,互补作用遭到破坏,在含有IPTG和X-gal平板上将出现白色菌落。利用“α—互补”进行重组子的筛选比利用“插入失活”法更加方便。应用pBR322质粒作克隆载体,其重组体转化子克隆的选择则需经过两个步骤,即还需从头一种抗性平板转移到另一种抗性平板。由此可见,使用pUC质粒载体进行基因克隆要比pBR322节省时间。

第三,具有多克隆位点MCS区

pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点,它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此,克隆在MCS当中的外源DN***段,可以方便地从pUC质粒载体转移到M13mp8载体上,进行克隆序列的核苷酸测序工作。同时,也正是由于具有MCS序列,可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI的外源DN***段,无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。

3. pGEM系列载体

pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2 743bp的基因组DNA中,编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。

pGEM系列载体与pUC系列之间主要差别是,它具有两个来自噬菌体的启动子,即T7启动子和SP6启动子,它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧(见图),故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶,那么克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。

                                                           三、λ噬菌体载体

l.λ噬菌体的一般生物学特性

λ噬菌体为线形双链DNA分子,长度约为49kb,在λDNA分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端,当λ噬菌体进入细菌细胞后,其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子,这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。

λ噬菌体是一个温和噬菌体,其生活周期有二种不同的类型,即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中,λ噬菌体的DNA分子一旦注入寄主细胞中,便可借助于寄主的复制和转录系统的功能,使自身DNA大量复制同时合成大量的外壳蛋白,并组装成大量(约100个)完整的噬菌体颗粒,最后,使宿主裂解并从细胞中释放出来。

在溶源周期中,λ噬菌体的DNA分子进入宿主后并不马上复制,而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中,与宿主染色体形成一体,并随宿主染色体的复制而复制,随宿主的分裂繁殖传给其子代细胞。

λDNA至少包括61个基因,除少数例外,大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。值得注意的是,在入λDNA分子中从J基因到N基因之间,大约占λDNA总长度三分之一的区段对于λ噬菌体的裂解周期而言是非必需的。这一区段的缺失或在此段插入外源DN***段,将不影响入噬菌体的增殖。这就是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。

2.λ噬菌体载体

(1)改造

野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆的载体。主要原因有二:

①λDNA基因组大而且复杂,特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点(如5个BamHI位点、6个BglⅡ位点和5个EcoRI位点等);

②λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于入基因组大小的75%~105%)的DNA分子。因此,λDNA只能作为小片段外源DNA分子(即2.5kb左右)的克隆载体。这一克隆容量显然不能满足大多数基因克隆工作的要求,必须对野生型λDNA进行改造。

扩充λDNA载体的克隆容量是改造λDNA的首要目标;此外改造工作还包括:①除去裂解周期所必需的基因区域中的限制酶识别位点,在非必需区引入合适的限性酶位点;②引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选;⑧通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体,以利于生物学防护等。

(2)载体类型:

只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的称为插入型载体,含有二个限制酶切点,在两个位点之间的DNA区段可以被外源DN***段所取代的载体称为取代型载体。

随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展,人们已经构建了许多带有多克隆位点的λ噬菌体载体,现在常规使用的λ噬菌体载体,不少既可用作插入型又可用作置换型。总之,多克隆位点的引入不仅极大地扩展了λ噬菌体的克隆范围,同时还大大地简化了其操作技术。

(3)重组体的筛选

λ噬菌体是利用插入失活或噬菌斑形成的原理筛选重组体的。常用的插入失活方法有大肠杆菌β—半乳糖苷酶失活和免疫功能失活两种。

利用β—半乳糖苷酶插入失活的载体(如λgt ll、λgt l8—23等),在生色底物(X—gal)和诱导物(1PTG)存在时,与相应的Lac—宿主铺平板可形成深蓝色噬菌斑。用这种载体进行克隆时,β—半乳糖苷酶基因的大部分被外源DN***段取代,所产生的重组噬菌体丧失α—互补能力,在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色噬菌斑。因此,对于这类入噬菌体载体,可通过组织化学方法进行重组子的筛选。

在免疫功能插入失活型载体的基因组中与免疫功能有关的DNA区段中含有一、二种限制酶的单一切点,当外源DN***段由这些位点插入时,就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破坏,而无法进入溶源周期。因此,凡带有外源DN***段的重组体只能形成清晰的噬菌斑,而没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑,不同的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。这种类型的载体中的λgtl0最为常用。

3.λ噬菌体载体的应用

λ噬菌体作为克隆载体主要用于:

(1)基因组DNA文库的构建;

(2)cDNA文库的构建

(3)大容量载体(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亚克隆等。

四、 粘粒载体(柯斯质粒载体)

1.柯斯质粒载体的构建

λ噬菌体克隆外源DNA的能力,虽说其理论上的极限值可达23kb,但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。当然,在一般的情况下,这样大小的DN***段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列(flankingsequence)。然而,大量的研究资料表明,许多基因的分子大小比正常预期的要大得多,有的可达35~40kb甚至更大。同时,应用λ噬菌体作载体,还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。不言而喻,在实际的研究工作中,特别是有关真核基因的结构与功能的研究,需要比λ噬菌体载体具有更大克隆能力的新型的载体。1978年,J.Collins及B.Hohn等人发展出的柯斯质粒载体(eosmidvectors)满足了这样的需要。

“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid"缩写而成的,其原意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。因此我们说,所谓柯斯质粒,乃是一类由人工构建的含有且DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它们兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆选择的优点,既能像质粒一样在寄主细胞内复制,也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。其克隆能力为31—45kb,而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。

2.柯斯质粒载体的特点

目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上,发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体,柯斯载体的特点大体上可归纳成如下三个方面:

第一,具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA,并在体外被包装成噬菌体颗粒之后,可以高效地转导对立噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子,便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体并不含有且噬菌体的全部必要基因,因此它不能够通过溶菌周期,无法形成子代噬菌体颗粒。

第二,具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子,因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制,并且在氯霉素作用下,同样也会获得进一步的扩增。此外,柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因,可供作重组体分子表型选择标记,其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。例如,在pHC79柯斯质粒基因组的PstI限制位点克隆,会导致ampr基因的失活;在BamHI和SalI限制位点克隆,又会造成tetr基因的失活。

第三,具有高容量的克隆能力。正如上面所述,柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点,一两个选择记号和COS位点等三个组成部分,其分子量较小,一般只有5~7kb左右。因此,可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成立噬菌体颗粒的最大外源DN***段,即柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。这个数字比且噬菌体载体及质粒载体的最大克隆能力都要大得多。同时,由于包装限制的缘故,柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果用作克隆载体的柯斯质粒的分子为5kb,那么插入的外源DN***段至少得有30kb长,才能包装形成具感染性的且噬菌体颗粒。由此可见,柯斯质粒克隆体系用于克隆大片段的DNA分子特别有效。

目前,已有多种柯斯质粒载体可用于基因克隆,图所示为最常用的柯斯质粒载体之一pJB8。

粘粒载体功能与λ噬菌体类似,但由于λ噬菌体具有较大的多功能性和较高的克隆效率,仍然是目前构建基因文库时首选的克隆载体,粘粒载体只有在以下两种特定的情况下使用:①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因;②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段,即当载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。

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